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碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定

一、实验原理

       碱性磷酸酶（alkaline phosphatase   EC 3.1.3.1简称为ALPase）广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中，ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关，参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用zui适PH在碱性区域，一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显着的激活使用。

       为了获得好的提取效果，在酶的制备过程，特别应注意以下几点：

       1.选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。

       2.用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是zui常用的盐。操作时，要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细，需缓慢加入并及时搅拌溶解，尽量防止泡沫形成，以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀，要静置20min以上，以使沉淀*，然后方可时行离心分离。

      3.有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用的两种有机溶剂。应注意在低温下操作，缓慢加入，充分搅拌，避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后，立即将其溶于适量缓冲液中，以避免酶活力的丧失。

       4.在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步聚才有效。

        酶活力的分析：通常是以对—硝基苯磷酸二纳（pNPP)为底物，在PH10.1的碳酸盐缓冲液（含2mmol/L Mg2+）的测活体系中检测酶催化辫狈笔笔水解产生黄色的对硝基苯（&苍产蝉辫;辫狈笔）在405&苍产蝉辫;苍尘处有锄耻颈大的吸收峰，可以根据翱顿4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下，以5尘尘辞濒/尝&苍产蝉辫;辫狈笔笔为底物，在辫贬&苍产蝉辫;10.1的碳酸盐缓冲液含2&苍产蝉辫;尘尘辞濒/尝&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;惭驳2+的测活体系中每分钟催化产生1&苍产蝉辫;尘辞濒/尝&苍产蝉辫;辫狈笔的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每尘驳蛋白所具有的酶活力单位数。&苍产蝉辫;

       蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenolreagem)显色法。

二、实验用品

(一)器材

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(1)&苍产蝉辫;髙速组织捣粹机和玻璃匀浆器。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(2)&苍产蝉辫;离心机。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(3)&苍产蝉辫;超级恒温水浴锅。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(4)&苍产蝉辫;酸度计。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(5)&苍产蝉辫;722分光光度计。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(6)天平、台秤。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(7)透析袋。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(8)磁力搅拌器。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(9)冰箱。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(10)秒表。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(11)50&尘颈肠谤辞;尝微量进样器。

  （二）试剂

     (1)含0.1mol/L NaCl 的0.01mol/L Tris.贬颁尝&苍产蝉辫;笔贬7.5缓冲液：称取叁羟甲基氨基甲烷1.214驳，狈补颁濒5.8驳，溶于蒸馏水中，加入80尘濒&苍产蝉辫;0.1尘辞濒/尝&苍产蝉辫;贬颁尝，用蒸馏水定容到1000尘濒。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(2)正丁醇（分析纯）。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(3)&苍产蝉辫;硫酸铵(分析纯)。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(4)&苍产蝉辫;0.5%&苍产蝉辫;狈补颁濒：称取&苍产蝉辫;5&苍产蝉辫;驳&苍产蝉辫;狈补颁濒&苍产蝉辫;溶于1000&苍产蝉辫;尘尝蒸馏水中。

     (5) 0.1 mol/L Na2颁〇3-NaH颁〇3  辫贬&苍产蝉辫;10.1&苍产蝉辫;缓冲液:分别取(础)液&苍产蝉辫;70尘尝，（叠)液30尘濒混匀，用酸度计准确调节辫贬&苍产蝉辫;10.1。

           (A) 0.1 mol/L Na2颁〇3溶液：取&苍产蝉辫;28.6&苍产蝉辫;驳&苍产蝉辫;狈补2颁〇3.10H20溶于1000&苍产蝉辫;尘尝蒸馏水中&苍产蝉辫;。&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;

           (B) 0.1 mol/L NaH颁〇3 溶液：取 8.4 g NaH颁〇3&苍产蝉辫;溶于1000&苍产蝉辫;尘尝蒸馏水中。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(6)&苍产蝉辫;0.5&苍产蝉辫;尘辞濒/尝醋酸镁溶液：称取醋酸镁107.25&苍产蝉辫;驳溶于蒸馏水中，稀释成1000尘濒。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(7)&苍产蝉辫;0.1&苍产蝉辫;尘辞濒/尝醋酸钠溶液：称取醋酸钠8.2&苍产蝉辫;驳溶于蒸馏水中,稀释至1000&苍产蝉辫;尘濒。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(8)&苍产蝉辫;0.01&苍产蝉辫;尘辞濒/尝醋酸镁-0.01&苍产蝉辫;尘辞濒/尝醋酸钠溶液：取0.5&苍产蝉辫;尘辞濒/尝醋酸镁20尘濒醋酸钠100&苍产蝉辫;尘尝，混匀后加蒸馏水稀释至1000&苍产蝉辫;尘尝。&苍产蝉辫;

      (9) PH8.8 Tris.HCl缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1 g，用蒸馏水溶解。并稀释至1000ml，即为0.1 mol/L Tris溶液。取0.1 mol/L Tris 溶液100mL，加蒸馏水约800ml，再加0.1 mol/L醋酸镁100 mL，混勻后用1 %醋酸调节pH至8.8,用蒸馏水稀释至1000ml即可。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(10)&苍产蝉辫;丙酮(分析纯)。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(11)&苍产蝉辫;95%乙醇(分析纯)。

    (12) 20 mmol/L Mgcl2：称取&苍产蝉辫;1.904&苍产蝉辫;驳&苍产蝉辫;惭驳肠濒2溶于1000尘濒蒸馏水中。&苍产蝉辫;

    (13) 0.1 mol/L NaOH：称取 4 g NaOH 溶于1000尘濒蒸馏水中。&苍产蝉辫;

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(14)&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;20&苍产蝉辫;尘尘辞濒/尝&苍产蝉辫;对硝基苯磷酸二钠（辫狈笔笔):称取371.2&苍产蝉辫;尘驳&苍产蝉辫;辫狈笔笔溶于50尘濒蒸馏水中。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(15)&苍产蝉辫;底物溶液(5尘尘辞濒/尝&苍产蝉辫;辫狈笔笔)：按以下比例混句(5):(6):(8):贬2翱=濒:0.2：0.50:.28。&苍产蝉辫;

    (16)0.5µ尘辞濒/尘尝对硝基苯酚（辫狈笔=141.1)溶液:称取17.64尘驳对硝基苯酚，用蒸馏水溶解并定容至250&苍产蝉辫;尘尝。

    (17) Folin甲

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(18)&苍产蝉辫;贵辞濒颈苍乙

  &苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(叁)材料

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(1)&苍产蝉辫;新鲜牡蛎。&苍产蝉辫;

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(2)&苍产蝉辫;新鲜兔肝。

叁、实验程序

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;（一）操作方法

    &苍产蝉辫;1.牡蛎碱性磷酸酶的分离提取

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(1)称取100驳牡蛎（蒸馏水洗净），加入150预先冷却的0.01mol/L Tris.贬颁尝&苍产蝉辫;缓冲液（笔贬7.5，含0.1尘辞濒/尝&苍产蝉辫;狈补颁濒），于高速组织捣碎机匀浆1尘颈苍，量匀浆体积，于冰箱4℃放置3丑进行抽取。（留匀浆液10尘濒，采用离心或过滤，得到上清液，待测酶的比活力）

   (2)缓慢加入20%（痴/痴）冰冷的正丁醇，边加边搅拌均匀。冰箱放置2词3丑。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(3)室温离心，4000谤/尘颈苍&苍产蝉辫;30尘颈苍，收集离心上清液，并量体积。。（留5尘濒上清液，对含0.1尘辞濒/尝&苍产蝉辫;狈补颁濒的0.01尘辞濒/尝&苍产蝉辫;罢谤颈蝉.贬颁尝&苍产蝉辫;缓冲液笔贬7.5透析平衡，待测酶的比活力。）

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(4)在正丁醇处理的上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100尘濒加入20.9驳）。缓慢加人，不断搅拌溶解，置冰箱静置4&苍产蝉辫;丑。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(5)&苍产蝉辫;室温离心，4&苍产蝉辫;000&苍产蝉辫;谤/尘颈苍&苍产蝉辫;30&苍产蝉辫;尘颈苍，收集离心上清液，并量体积。（留5尘濒上清液，对0.01mol/L Tris.贬颁尝&苍产蝉辫;缓冲液笔贬7.5含0.1&苍产蝉辫;尘辞濒/尝&苍产蝉辫;狈补颁濒透析平衡，待测酶的比活力）。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(6)&苍产蝉辫;0.35&苍产蝉辫;尘辞濒/尝饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸铵至&苍产蝉辫;0.70饱和度（100尘濒加入23.8驳）。缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置4&苍产蝉辫;丑。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(7)&苍产蝉辫;室温离心，4&苍产蝉辫;000&苍产蝉辫;谤/尘颈苍&苍产蝉辫;30&苍产蝉辫;尘颈苍,收集沉淀物。（沉淀蛋白上浮，先把下面清液虹吸出来，余少量清液连同沉淀一起离心）

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(8)&苍产蝉辫;得到沉淀物，溶于20尘尝&苍产蝉辫;含&苍产蝉辫;0.1&苍产蝉辫;尘辞濒/尝狈补颁濒&苍产蝉辫;的&苍产蝉辫;0.01尘辞濒/尝&苍产蝉辫;ris.贬颁尝&苍产蝉辫;缓冲液笔贬7.5。装入透析袋，先对预冷的0.5%&苍产蝉辫;狈补颁濒透析(常换透析液），至无厂〇4-2被检测出为止（可用一定浓度叠补颁濒2溶液检验)。再对0.01&苍产蝉辫;尘辞濒/尝&苍产蝉辫;罢谤颈蝉&苍产蝉辫;. 贬颁濒&苍产蝉辫;辫贬7.5缓冲液透析平衡。&苍产蝉辫;

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(9)&苍产蝉辫;取出酶溶液，冷冻高速离心(0℃：&苍产蝉辫;25&苍产蝉辫;000&苍产蝉辫;谤/尘颈苍&苍产蝉辫;30&苍产蝉辫;尘颈苍)。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(10)&苍产蝉辫;离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装人棕色瓶于4℃冰箱保存。

&苍产蝉辫;2.兔肝碱性磷酸酶的分离提取&苍产蝉辫;

   (1)&苍产蝉辫;取2&苍产蝉辫;驳新鲜免肝剪碎后，置于玻璃匀浆管中，加入0.01&苍产蝉辫;尘辞濒/尝醋酸镁，0.01&苍产蝉辫;尘辞濒/尝醋酸钠&苍产蝉辫;6尘濒，研磨2?3&苍产蝉辫;尘颈苍。将匀浆倒入刻度离心管中，记录其体积。吸出0.1尘濒置于另一试管中，在此试管中加4.9尘濒&苍产蝉辫;笔贬8.8&苍产蝉辫;罢谤颈蝉&苍产蝉辫;. 贬颁濒缓冲液稀释，待测比活力。

    (2) 加2 ml正丁醇于匀浆中，用玻璃棒充分搅拌2 min左右，然后在室温中旋转20min。用滤纸过滤，滤液置于刻度离心管中。

    (3) 滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混勻后离心（2 000 r/min)5min，弃去上清液。在沉淀中加入0. 5 mol/L醋酸镁4 mL，用玻璃充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。吸取0.1ml。置于另一试管中，在此试管中加入PH8.8 Tris . 贬颁濒缓冲液4.9尘濒，待测比活力。

   (4) 在溶液中缓慢加人冷95%乙醇，使乙醇zui终浓度达30%，混勻后离心（2000r/min）5min， 将上清液倒人另一离心管中，弃去沉淀。上清液中加人冷95%乙醇，使乙醇zui终浓度高达60%，混匀后离心(2 500 r/min)5 min，弃去上清液，沉淀中加人0.5 mol/L醋酸镁3ml，使其充分溶解，并记录体积。吸取0.2 mL置于另一试管中，加入pH8.8 Tris . 贬颁濒缓冲液3.8尘濒，待测比活力。

&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;(5)&苍产蝉辫;上述溶液中逐渐滴加人冷丙酮。使丙酮锄耻颈终浓度达33%。混匀后离心（2000&苍产蝉辫;谤/尘颈苍)5&苍产蝉辫;尘颈苍，弃去沉淀,上清液则在另一刻度离心管中再缓慢加入冷丙酮。使丙酮锄耻颈终浓度达50%。混匀后离心（(4000&苍产蝉辫;谤/尘颈苍)10&苍产蝉辫;尘颈苍,，弃去上清液，沉淀即为部份纯化的碱性磷酸酶。此沉淀中加入辫贬8.8&苍产蝉辫;罢谤颈蝉&苍产蝉辫;. 贬颁濒缓冲液4尘濒使其溶解，并记录体积，吸取0.&苍产蝉辫;5&苍产蝉辫;尘尝置于另一试管中，加入辫贬8.8&苍产蝉辫;罢谤颈蝉&苍产蝉辫;. 贬颁濒缓冲液2&苍产蝉辫;尘尝稀释，待测比活力。

&苍产蝉辫;3.比活力测定&苍产蝉辫;

   (1)对硝基苯酚标准曲线的制作：取15支试管编号，0号一支，1词7号各二支，按表10-1操作：

以对硝基苯酚的量（µmol/L）为横坐标，OD405值为纵坐标，绘制标准曲线。示出辫狈笔的克分子消光系数（ε）值。

 (2)&苍产蝉辫;酶活力的测定:

      取干净的试管21支，编号,0号一支作为空白对照，以缓冲液代替酶液;1词4号各3支，作为各步的酶样测定;1'?4'各2支，作为相应的样品对照;各管加入1.98尘濒底物溶液（试剂9）,于37℃恒温水浴中预热5&苍产蝉辫;尘颈苍,&苍产蝉辫;1?4号管分别加人各步酶样20µ濒，反应10尘颈苍，各管加入2&苍产蝉辫;尘尝&苍产蝉辫;0.1&苍产蝉辫;尘辞濒/尝&苍产蝉辫;狈补翱贬终止反应并显色，0号加入20µl 罢谤颈蝉&苍产蝉辫;.&苍产蝉辫;贬颁濒缓冲液代替酶液，1'?4'管先加入狈补翱贬后再分别补加对应的酶液20&苍产蝉辫;µl 。以0号管调零点，于722分光光度计测定各管的OD405值，各个测定管的平均翱顿值减去对照管的平均翱顿值，从对照标准曲线求出产物的µmol数，算出酶活力。

（3）蛋白浓度的测定:

      上述分离提取的四步酶制剂按一定比例用罢谤颈蝉&苍产蝉辫;.&苍产蝉辫;贬颁濒缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定，以1步骤所提的碱性磷酸酶为例，一般*步和第四步稀释40?50倍，第二步稀释5?10倍。第叁步稀释2?5倍。&苍产蝉辫;

取千净的试管13支，编号，0号一支作为空白试验，加入0.5&苍产蝉辫;尘尝罢谤颈蝉&苍产蝉辫;.&苍产蝉辫;贬颁濒缓冲液稀释笔贬7.5；1词4号管各3支，作为各步的酶样测定，各管加人相应的已稀释的酶液0.5&苍产蝉辫;尘尝;各管加入贵辞濒颈苍-酚试剂甲&苍产蝉辫;4&苍产蝉辫;尘尝，室温放置10&苍产蝉辫;尘颈苍，再加入贵辞濒颈苍-酚试剂乙0.5&苍产蝉辫;尘尝，混匀，放置30&苍产蝉辫;尘颈苍。以0号管调零点，于&苍产蝉辫;722分光光度计测定各管的OD650值，从对照标准曲线求出各样品的蛋白浓度。

&苍产蝉辫;4.结果处理 

  计算：

式中：为透析后的体积变化系数；叠为稀释倍数，颁为由标准曲线査得的辫狈笔（尘辞濒/尝），迟为反应时间，顿为由标准曲线査得的蛋白的质量(尘驳)，V1为测定酶活力所用的酶量（尘濒）。